Genetic diversity in oocyte donors used in in vitro bovine embryo production programs in Brazil / Diversidad genética en donadoras de ovocitos utilizadas en programas de producción de embriones bovinos in vitro en Brasil / Diversidade genética em doadoras de oócitos utilizadas em programas de produção de embriões bovinos in vitro no Brasil

Abstract Background: Current reproductive management of bovine elite populations involves the use of assisted reproductive technologies (ARTs), aiming to obtain the greatest genetic gain. However, inadequate use of ARTs may lead to loss of genetic diversity in the offspring. Objective: To assess the genetic diversity in elite female cattle populations used in commercial in vitro embryo production. Methods: Using genetic and ecological approaches for the study of populations based on microsatellite markers, we assessed the genetic diversity between and within populations of cows used in commercial in vitro embryo production programs in Brazil. Results: Endogamy within populations varied from zero to 9.1%, while heterozygosity between populations (FST) was <0.05 in the different population interactions. AMOVA showed 1% variation between populations, 8% between individuals and 91% within individuals. The dimensionality reduction method utilized indicated a lack of structure in the populations analyzed, identifying two main clusters in the three populations. Conclusions: Low genetic diversity between cow populations associated with commercial programs of in vitro embryo production in Brazil was evidenced. Variable levels of endogamy within the populations were observed. Approaches of population genetics as well as ecological diversity can be implemented to more thoroughly estimate genetic diversity in livestock populations.

Resumen Antecedentes: El actual manejo reproductivo en poblaciones de bovinos de élite incluye la utilización de tecnologías de reproducción asistida (ARTs) con el fin de obtener mayor ganancia genética. Sin embargo, el uso inadecuado de las ART puede llevar a la pérdida de diversidad genética en los descendientes. Objetivo: Evaluar la diversidad genética en poblaciones de vacas de élite utilizadas en la producción comercial de embriones bovinos in vitro. Métodos: Utilizando abordajes de la genética y ecología de poblaciones basados en marcadores microsatélites, evaluamos la diversidad genética entre y dentro de poblaciones de vacas participantes de programas comerciales de producción de embriones in vitro en Brasil. Resultados: La endogamia dentro de las poblaciones varió de cero a 9,1%, mientras que la heterocigosidad entre poblaciones (FST) fue <0,05 en las diferentes interacciones de la población. El AMOVA mostró variación del 1% entre poblaciones, 8% entre individuos y 91% dentro de individuos. El método de reducción de dimensionalidad utilizado indicó una falta de estructura en las poblaciones analizadas, identificando dos grupos principales en las tres poblaciones. Conclusiones: Se evidenció una baja diversidad genética entre las poblaciones de vacas asociadas a programas comerciales de producción de embriones in vitro en Brasil. Se evidenciaron niveles variables de endogamia entre las poblaciones. Abordajes de la genética poblacional, así como de diversidad ecológica pueden ser implementados para estimar de manera más amplia la diversidad genética en poblaciones animales de interés pecuario.

Resumo Antecedentes: O atual manejo reprodutivo das populações de elite em bovinos envolve o uso de tecnologias de reprodução assistida (ARTs), visando obter o maior ganho genético. No entanto, o uso inadequado de ARTs pode levar à perda de diversidade genética na prole. Objetivo: Avaliar a diversidade genética em populações de vacas de elite utilizadas na produção comercial de embriões bovinos in vitro. Métodos: Utilizando abordagens da genética e ecologia de populações baseadas em marcadores microssatélites, foi avaliada a diversidade genética entre e dentro das populações de vacas participantes de programas comercias de produção in vitro de embriões. Resultados: A endogamia dentro das populações variou de zero a 9,1%, enquanto a heterozigosidade entre populações (FST) foi <0,05 nas diferentes interações populacionais. AMOVA mostrou variação de 1% entre populações, 8% entre indivíduos e 91% dentro de indivíduos. O método de redução de dimensionalidade utilizado indicou uma falta de estrutura nas populações analisadas, identificando dois clusters principais nas três populações. Conclusões: Baixa diversidade genética entre populações de vacas associadas a programas de produção in vitro de embriões foi evidenciada. Níveis de endogamia variáveis dentro das populações foram observados. Abordagens da genética populacional assim como de diversidade ecológica podem ser implementadas na tentativa de estimar de maneira mais abrangente a diversidade genética em populações animais de interesse pecuário.

Antioxidant supplementation in female ruminants during the periconceptional period: A review / Suplementación con antioxidantes en hembras rumiantes durante el periodo periconcepcional Revisión de literatura / Suplementação de antioxidantes em fêmeas de ruminantes durante o período periconcepcional Revisão de literatura

Abstract Oxidative stress is the result of an imbalance between free radicals and antioxidants. Under normal physiological conditions, free radicals are involved in reproductive events such as cell cycle activation, ovulation and luteolysis. However, when an overproduction of free radicals surpasses antioxidant capacity, oxidative damage, reproductive anomalies and diminished fertility occur. Supplementation with antioxidants prevents oxidative damage and can be incorporated into reproductive management to improve fertility in females. Selection of the preovulatory follicle, ovulation, fertilization, embryo development and formation of the corpus luteum occur during the periconceptional period. This is a dynamic period and the events are susceptible to oxidative stress damage. Therefore, the objective of this review is to discuss the effect of oxidative stress on reproductive events during the periconceptional period, as well as to address antioxidant supplementation during this period.

Resumen El estrés oxidativo es generado por un desbalance entre radicales libres y antioxidantes. Bajo condiciones fisiológicas normales, los radicales libres participan en eventos reproductivos tales como activación del ciclo celular, ovulación y luteólisis. Sin embargo, cuando estos son producidos en cantidades que sobrepasan la capacidad antioxidante del organismo producen daño oxidativo y trastornos reproductivos que disminuyen la fertilidad de la hembra. La suplementación con antioxidantes previene el daño oxidativo y su incorporación a programas de manejo reproductivo puede ser una opción para mejorar la fertilidad de la hembra. La selección del folículo preovulatorio, ovulación, fecundación, desarrollo embrionario y formación del cuerpo lúteo ocurren durante el periodo periconcepcional. Este es un periodo dinámico y los eventos que ocurren en él son susceptibles a daño por estrés oxidativo. Por tanto, el objetivo de esta revisión es discutir el efecto del estrés oxidativo en los eventos reproductivos durante el periodo periconcepcional, así como la suplementación de antioxidantes en rumiantes durante este periodo.

Resumo O stress oxidativo é gerado por um desequilíbrio entre radicais livres e antioxidantes. Sob condições fisiológicas normais, os radicais livres participam de eventos reprodutivos, como ativação do ciclo estral, ovulação e luteólise. No entanto, quando é produzido em quantidades que excedem a capacidade antioxidante do organismo, produzem danos oxidativos e distúrbios reprodutivos que diminuem a fertilidade da fêmea. A suplementação com antioxidantes previne o dano oxidativo e sua incorporação em programas de gerenciamento reprodutivo pode ser uma opção para melhorar a fertilidade da fêmea. A seleção do folículo pré-ovulatório, ovulação, fecundação, desenvolvimento embrionário e formação do corpo lúteo ocorrem durante o período periconcepcional. Este é um período dinâmico e os eventos que ocorrem são suscetíveis ao dano por estresse oxidativo. Portanto, o objetivo dessa revisão é fornecer ao leitor conhecimento sobre o efeito do estresse oxidativo em eventos reprodutivos durante o período periconcepcional, e também discutir a suplementação com antioxidantes em ruminantes durante este período.

In vitro fertilization of porcine oocytes is affected by spermatic coincubation time / A fertilização in vitro de ovócitos suínos é afetada pelo tempo de coincubação espermático

The aim was to study the effects of different gamete coincubation times on porcine in vitro fertilization (IVF), and to verify whether efficiency could be improved by reducing oocyte exposure time to spermatozoa during IVF. In groups of 50, a total of 508 immature cumulus-oocyte complexes (COCs) were matured in NCSU-37 medium. The COCs were cultured for 44 hours and then inseminated with in natura semen (2,000 spermatozoa/oocyte). The sperm and oocytes were coincubated according to the following treatments (T): T1 = oocytes exposed to spermatozoa for one hour (173 oocytes), T2 = oocytes exposed to spermatozoa for two hours (170 oocytes), and T3 = oocytes exposed to spermatozoa for three hours (165 oocytes). After these coincubation periods, the oocytes were washed in fertilization medium (TALP medium) to remove spermatozoa not bound to the zona pellucida and cultured in another similar medium (containing no sperm). Eighteen to twenty hours after fertilization, the putative zygotes were stained in Hoechst-33342 to evaluate the IVF results. The penetration rate was higher (P<0.05) after two hours of coincubation time than it was for one or three hours. Furthermore, 68.60% of the ova coincubated with the spermatozoa for two hours were monospermic. The oocytes exposed to spermatozoa for one hour (T1) presented a higher (P<0.01) rate of polyspermy than those in T2 and T3. Fertilization performance (%) did not differ (P>0.05) between oocytes exposed to spermatozoa for one (T1) and three hours (T3). However, optimum (P=0.048) results were obtained after two hours of coincubation, when the rate of fertilization performance was 50.16±8.52%. The number of penetrated sperm per oocyte, as well as male pronucleus formation, did not differ (P>0.05) between the treatments evaluated. Under these assay conditions, especially in relation to the sperm concentration used, gamete coincubation for a period of two hours appears to be optimal for monospermy and fertilization performance. Thus, it is the optimal time period for obtaining a large number of pig embryos capable of normal development.(AU)

Esse estudo foi realizado para avaliar os efeitos de diferentes tempos de coincubação dos gametas sobre a fertilização in vitro (FIV) de suínos e se a eficiência dessa técnica poderia ser melhorada pela redução no período que os ovócitos são expostos aos espermatozoides durante a FIV. Um total de 508 (em grupos de 50) complexos cumulus-ovócito (COCs) imaturos foram maturados no meio NCSU-37. Os COCs foram cultivados por 40-44 horas e então inseminados com sêmen in natura (2.000 espermatozoides/ovócito). Os espermatozoides e ovócitos foram coincubados de acordo com os seguintes tratamentos (T): T1 = ovócitos expostos aos espermatozoides por uma hora (173 ovócitos); T2 = ovócitos expostos aos espermatozoides por duas horas (170 ovócitos) e T3 = ovócitos expostos aos espermatozoides por três horas (165 ovócitos). Após esses períodos de coincubação, os ovócitos foram lavados em meio de fertilização (meio TALP) para remoção dos espermazoides não ligados a zona pelúcida e cultivados em outro mesmo meio (não contendo espermatozoides). Após 18-20 horas de fertilização, os prováveis zigotos foram corados com Hoechst-33342 para avaliação dos resultados da FIV. A taxa de penetração foi maior (P<0,05) após o tempo de coincubação de duas horas em comparação a uma e três horas. Além disso, 68,60% dos ovócitos coincubados com os espermatozoides por duas horas foram monospérmicos. Os ovócitos expostos aos espermatozoides por uma hora (T1) apresentaram elevada (P<0,01) taxa de polispermia em comparação com o T2 e T3. A eficiência da fertilização (%) não diferiu (P>0,05) entre os ovócitos expostos aos espermatozoides por uma (T1) e três horas (T3). Entretanto, ótimos (P=0,048) resultados foram obtidos após duas horas de coincubação, quando a taxa da eficiência da fertilização foi 50,16 ± 8,52%. O número de espermatozoides penetrados por ovócito e a formação de pro-núcleo masculino não diferiu (P>0,05) entre os tratamentos avaliados. Sob as condições de ensaio realizadas, especialmente em relação à concentração espermática utilizada, a coincubação dos gametas por um período de duas horas parece ser ótima para as taxas de monospermia e eficiência da fertilização. Portanto, um tempo provavelmente ótimo para obter um elevado número de embriões suínos capazes de ter um desenvolvimento normal.(AU)

Identificação imuno-histoquímica de VEGF e IGF-1 em ovários de cadelas no anestro e estro / Immunohistochemical identification of VEGF and IGF-1 in ovaries of bitches on anestrus and estrus

Com o objetivo de verificar a presença de VEGF e IGF-1 nos ovários de cadelas, foram realizadas análises imuno-histoquímicas do estroma cortical; teca e granulosa de folículos secundários, terciários e terciários pré-ovulatórios luteinizados; e ovócitos de folículos primários, secundários e terciários de ovários de cinco cadelas em anestro (Anest) e cinco em estro (Est). A identificação das fases do ciclo estral foi realizada por citologia vaginal associada a dosagem plasmática de progesterona. Os ovários foram submetidos a tratamento imuno-histoquímico para identificação de VEGF (anticorpo primário PU 360-UP, Biogenex, USA; diluição 1:30) e IGF-1 (anticorpo primário PabCa, Gro-Pep, Austrália; diluição 1:100). Determinou-se um índice de imunomarcação (IM), para cada tecido avaliado, pela razão entre a área positivamente marcada dividida pela área total analisada. Para os ovócitos, verificou-se imunomarcação positiva ou negativa. As comparações de IM entre tecidos foram realizadas pelo teste de Wilcoxon (diferentes tecidos em mesmo grupo) ou Mann-Whitney (mesmo tecido entre diferentes grupos), todas no nível de 5% de significância. VEGF e IGF-1 foram identificados, de forma semelhante (P>0,05), em todas as estruturas avaliadas em ambos os grupos experimentais. Conclui-se que esses fatores de crescimento estão presentes em cadelas no anestro e estro, no estroma cortical ovariano, folículos em diferentes estádios de desenvolvimento e ovócitos.(AU)

In order to verify the presence of VEGF and IGF-1 in the ovaries of bitches, immunohistochemical analyzes of the cortical stroma; theca and granulosa of secondary, tertiary and tertiary luteinized preovulatory follicles; and oocytes of primary, secondary and tertiary follicles of ovaries from five bitches in anestrous (Anest) and five in estrus (Est) was performed. The identification of the phases of the estrous cycle was performed by vaginal cytology associated with the measurement of plasma progesterone. The ovaries were treated for immunohistochemical identification of VEGF (PU 360 primary antibody-UP, Biogenex, USA, dilution 1:30) and IGF-1 (primary antibody PabCa, Gro-Pep, Australia; 1:100 dilution). The immunostaining index (MI) was determined for each tissue by the ratio of positively marked area divided by total analyzed area. For oocytes immunostaining was determined as positive or negative. Comparisons of IM between tissues were performed with the Wilcoxon test (deferent tissues in the same group) or Mann-Whitney test (same tissue between different groups), all at 5% significance level. VEGF and IGF-1 have been similarly identified (P>0.05) in all structures evaluated in both groups. It is concluded that in bitches in estrus and anestrous these growth factors are present in ovary cortical stroma, follicles at different stages of development and oocytes.(AU)

Histological description of oogenesis in chiton virgulatus (Mollusca: Polyplacophora) / Descripción histológica de la ovogénesis de chiton virgulatus (Mollusca: Polyplacophora)

This paper describes the oogenesis of Chiton virgulatus, based on histological observations under transmission and scanning electron microscopy. Three oocyte types were identified: i) previtellogenic oocytes with a mean diameter of 50±20.5 µm, surrounded by elongated follicular cells of approximately 5 µm, ii) immature vitellogenic oocytes with a mean diameter of 113±15.3 µm and small cytoplasmic projections denoting the onset of the oocyte hull development; adjacent to each projection are pores approximately 0.7 µm in diameter, and iii) mature vitellogenic oocytes with a mean diameter of 146±24.8 µm; the oocyte cytoplasmic projections grow and its apical zone becomes trident-shaped; follicular cells adopt a bulbous shape due to the growth of the elongation and can reach up to 20 µm in length. The morphology and ultrastructure of the projections of the mature vitellogenic oocyte, as well as the size of pores at their base, are specific to C. virgulatus; therefore, these features could be used in taxonomic or fertilization studies.

En el presente trabajo se describe la ovogénesis de Chiton virgulatus, utilizando histología y las técnicas de microscopía electrónica de barrido y de transmisión. Se identificaron tres tipos de ovocitos: i) ovocitos previtelogénicos con un diámetro promedio de 50±20,5 µm, rodeados por células foliculares de forma alargada y un tamaño de aproximadamente 5 µm, ii) ovocitos vitelogénicos inmaduros con un diámetro promedio de 113±15,3 µm, este tipo de ovocitos presentan pequeñas proyecciones citoplasmáticas, que indican el inicio del desarrollo del casco del ovocito. Adyacentes a cada prolongación se presentan poros con un diámetro aproximado de 0,7 µm y iii) ovocitos vitelogénicos maduros con un diámetro promedio de 146±24,8 µm, las proyecciones citoplasmáticas del casco del ovocito crecen y en su parte apical adquieren la forma de un tridente, las células foliculares, dado el crecimiento de la prolongación toman el aspecto bulboso y llegan a medir hasta 20 µm de longitud. La morfología y la ultraestructura de las proyecciones del casco del ovocito vitelogénico maduro, así como el tamaño del poro en la base de las proyecciones son particulares para C. virgulatus, dichas características podrían ser utilizadas en trabajos de taxonomía y fertilización.

Efeito do soro de cadela em estro na maturação in vitro de ovócitos caninos / Effect of estrus bitch serum on in vitro maturation of canine oocyte

Avaliou-se o efeito do soro de cadela em estro na maturação in vitro de ovócitos caninos, utilizando-se 92 ovócitos de cadelas, submetidas à cirurgia eletiva de ovarioisterectomia. Os ovócitos foram selecionados e distribuídos em dois tratamentos: T1 (n = 48), ovócitos cultivados in vitro durante 96 horas utilizando meio base - TCM199 + 5µg/mL de LH + 20µg/mL de FSH - mais 10 por cento de soro inativado de vaca em estro e T2 (n = 44), ovócitos cultivados em meio base mais 10 por cento de soro inativado de cadela em estro. O percentual de ovócitos observados em metáfase I não indicou diferenças (P>0,05) entre T1 (2,1 por cento) e T2 (0,0 por cento), porém a taxa de ovócitos maduros (metáfase II) foi diferente (P<0,05), sendo 27,1 por cento em T1 e 47,7 por cento em T2. O mesmo fato ocorreu com a taxa de cromatina condensada (P<0,01), com 14,6 e 0,0 por cento, respectivamente. Nos ovócitos sem configuração cromossômica, não foram observadas diferenças (P>0,05), sendo 56,3 por cento em T1 e 52,3 por cento em T2. Estes resultados indicam que a adição de soro de cadela em estro no meio de cultivo oferece melhores condições para o desenvolvimento in vitro, quando comparado à de soro de vaca em estro.

This study aimed to evaluate the effect of estrus on in vitro canine oocyte. A total of 92 oocyte from bitches under ovary-hysterectomy surgery was used. The oocytes were selected and randomly assigned to two different treatments, being T1 (n = 48) in vitro cultured for 96h using basic medium (TCM199 + 5µg/mL of LH + 20µg/mL of FSH), plus 10 percent of cow inactive serum in estrus and T2 (n = 44) basic medium plus 10 percent of bitch inactive serum in estrus. The percentage of oocyte observed on metaphase I do not indicate a difference (P>0.05) between T1 (2.1 percent) and T2 (0.0 percent). However, the rate of mature oocyte (metaphase II) was different (P<0.05), being 27.1 percent for T1 and 47.7 percent for T2. There was difference (P<0.05) in the condensed chromatin rate for T1 (14.6 percent) and T2 (0.0 percent), respectively. There was no difference (P>0.05) between T1 (56.3 percent) and T2 (52.3 percent) in oocyte with no chromosome configuration. These results indicate that supplementation with estrus bitch serum on culture media offer better conditions to in vitro development, when compared to estrus cow serum.

Fecundidade da manjuba Curimatella lepidura (CURIMATIDAE) na represa de Três Marias, rio São Francisco, MG / Fecundity of manjuba Curimatella lepidura (CURIMATIDAE) in the Três Marias reservoir, São Francisco river, MG

Foram determinados os tamanhos dos ovócitos e as fecundidades residual e relativa ao peso de corpo, ao comprimento padrão, ao peso do ovário e ao peso de corpo do líquido dos ovócitos vitelogênicos, e a fecundidade absoluta de 230 fêmeas de manjubas (Curimatellalepidura) coletadas no reservatório de Três Marias, rio São Francisco, MG durante três anos de coleta. Foi utilizado o método gravimétrico para determinar a quantidade de ovócitos vitelogênicos, que foram separados dos avitelogênicos, por diferença de peso. O diâmetro médio dos ovócitos foi de 711±44µm. O valor médio da fecundidade absoluta foi de 60.994,9±27.142,7 ovócitos por fêmea no estádio 2C de maturação (maduro). A fecundidade média relativa ao peso corporal e ao peso do ovário foi de 1.294,1±437,5 e 8.293,8±1.961,9 ovócitos por grama, respectivamente. Não houve diferença significativa (P<0,05) entre as fecundidades absolutas médias nos três anos de pesquisa. Foram encontrados elevados coeficientes de correlação, e os modelos lineares e potenciais foram os mais adequados para expressar as fecundidades absolutas e relativas, ou seja, quanto maior o grau de maturidade, maior a fecundidade dos peixes.

The sizes of vitellogenic oocytes and fecundity of 230 females of manjubas (Curimatella lepidura) from the Três Marias reservoir, river São Francisco, MG, was determined throughout three years of monthly captures. Gravimetric method was used to determine the quantities of vitellogenic oocytes, which were separated from no vitellogenics by weight difference and using water flow. The average diameter of vitellogenic oocytes was 711±44µm. The mean absolute fecundity was 60994.9±27142.7 oocytes per female in stage 2C of maturation (mature). The average fecundity relative to body weight and ovarian weight was 1294.1±437.5 and 8293.8±1961.9 oocytes per gram, respectively. There was no significant difference (P<0.05) between fecundity during the three years of research. High correlation coefficients were found, and the linear and potential models were the most appropriate to express the absolute and relative fecundities, i.e., the higher the maturity degree, higher the fecundity.

Evaluación de la capacidad de desarrollo in vitro de ovocitos bovinos provenientes de vacas con predominancia fenotípica Bos taurus y Bos indicus / Evaluation of in vitro development capacity of bovine oocytes obtained from predominantly Bos taurus and Bos indicus cows

El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad de desarrollo in vitro de ovocitos bovinos de vacas mestizas B. taurus y B. indicus. Los ovocitos fueron recuperados de ovarios de hembras bovinas provenientes de un matadero comercial. Para la obtención de los complejos cumulus-ovocitos (CCO) se realizó la técnica de slicing, seleccionando los ovocitos que tenían al menos una capa de células del cumulus y un citoplasma homogéneo. Los ovocitos seleccionados fueron madurados y fecundados in vitro (MIV-FIV). Se utilizó semen de un toro Brahman puro (B. indicus). Para la evaluación de la MIV y FIV todos los ovocitos se fijaron por al menos 24 h a 4°C en solución metanol-ácido acético (3:1) y teñidos con aceto-orceína al 1,1%. La tasa de maduración de ovocitos de vacas con predominancia fenotípica B. indicus fue del 66,17% mientras que las vacas con predominancia fenotípica B. taurus alcanzaron un 50,94% (P>0,05). En cuanto a la tasa de fecundación se obtuvo un 14,28 y 35,72% de ovocitos penetrados normalmente y anormales, respectivamente, para el grupo de ovocitos con predominancia fenotípica B. indicus. Mientras que para vacas con predominancia fenotípica B. taurus, un 10,22% correspondió a ovocitos penetrados normales y 19,31% de ovocitos penetrados anormales, sin encontrar diferencias estadísticamente significativas en ambos grupos. Los presentes resultados, tanto para la progresión meiótica como para las tasas de fecundación, indican que los ovocitos de vacas mestizas con predominancia fenotípica B. indicus son más competentes en las primeras etapas de desarrollo in vitro que los ovocitos de vacas mestizas con predominancia fenotípica B. taurus.

The aim of this study was to evaluate the in vitro development capacity of bovine oocytes from crossbred B. taurus and B. indicus cows. Oocytes from bovine cows were collected from commercial slaughterhouse. The cumulus-oocyte complex (COC) ovaries were obtained by Slicing technique, selecting those oocytes that had 2 to 3 layers of cumulus cells and homogeneous cytoplasm. After selection oocytes proceed with maturation (IVM) and fertilization in vitro (IVF). It used semen from a pure Brahman bull (B. indicus). For the assessment of IVM as for IVF oocytes were fixed for about 24 hours at 4°C in methanol-acetic acid (3:1) solution and stained with 1.1% aceto-orcein. The maturation rate of oocytes from cows with B. indicus phenotypic predominance was 66.17%, whereas cows with B. taurus phenotypic predominance 50.94% (P>0.05). Fertilization rate obtained in B. indicus phenotypic predominance group was 14.28% of oocytes normal penetrated and abnormal penetrated 35.72%, for cows with a phenotypic predominance B. taurus oocytes normal penetrated were 10.22% and 19.31% of abnormal oocytes penetrated. In conclusion, the present results indicate that oocytes from cows with phenotypic predominance B. indicus are more competent in the early stages of development in vitro than oocytes from cows with phenotypic predominance B. taurus.

Efecto de la suplementación con L-cisteína en la maduración in vitro de ovocitos bovinos / L-cysteine supplementation effect on the in vitro maturation of bovine oocytes

utilizada como herramienta para el estudio de diversos aspectos relacionados con la maduración de ovocitos, la fecundación y el desarrollo temprano del embrión en condiciones in vitro. La L-cisteína es un sustrato externo requerido para la síntesis del glutation en la maduración de ovocitos bovinos. Con el objetivo de evaluar el efecto de la suplementación con L-cisteína sobre la maduración in vitro de ovocitos bovinos, se llevó a cabo un experimento con ovarios obtenidos de vacas mestizas beneficiadas en una sala de matanza local. Se utilizaron tres tratamientos con diferentes concentraciones T1: 0 mM; T2: 0,1 mM y T3: 1,0 mM. Aproximadamente 400 Complejos Cumulus Ovocito (COCs) por tratamiento se maduraron en pozos de 500 µL del medio de maduración (TCM-199), distribuyéndose 50 COC por pozo en una incubadora a 5% de CO2, a 38,5°C y con humedad saturada. Los datos se analizaron por medio de un análisis de varianza (ANAVAR). No se observaron diferencias significativas entre los tratamientos en el porcentaje de ovocitos que llegaron a Metafase II (MII, T1: 72,77%, T2: 67,47% y T3: 70,43%). Los resultados indican que la suplementación con L-cisteína durante la maduración no ejerció un efecto sobre el porcentaje de ovocitos bovinos que alcanzaron el estado de MII, sin embargo se deben realizar otras investigaciones para determinar el efecto ulterior que tiene la L-cisteína adicionada en la maduración sobre la fecundación y el desarrollo embrionario in vitro.

In vitro fertilization (IVF) is now a routine technique in a number of biotechnology research laboratories worldwide. IVF is used as a tool for the study of various aspects related to oocytes maturation, fertilization and early embryo development. L-cysteine constitutes an external substrate required for synthesis of glutathione in the maturation of cattle oocytes. In order to study the effect of L-cysteine supplementation on in vitro maturation of cattle oocytes, ovaries were obtained from crossbred cows culled at a local slaughterhouse. Three different in vitro maturation treatments were utilized. Each treatment had a different concentrations of L-cysteine: T1: 0 mM, T2: 0.1 mM and T3: 1.0 mM. Approximately 400 Cumulus Oocyte Complexes (COCs) were matured in wells of 500 ìL of maturation medium (TCM-199), with 5% CO2 at 38.5°C and saturated relative humidity. Data were analyzed using analysis of variance (ANOVA). There were no significant differences between treatments in term of oocytes that arrived to Metafase II (MII, T1: 72.77%, T2: 67.47% and T3: 70.43%). Results indicate that supplementation with L-cysteine during maturation did not possitively affect the percentage of bovine oocytes that reached the M II state. Nonetheless further research should be carried out to determine the effect of L-cysteine supplementation during maturation, on fertilization and on embryonic development in vitro.

Considerações e questionamentos sobre as evidências da ovogênese pós-natal em mamíferos / Considerations and questionaments about evidence of post-natal ovogenesis in mammalian

É apresentada uma revisão de literatura sobre a origem dos ovócitos primários em ovários de fêmeas adultas de mamíferos. Apesar de ser considerado um processo exclusivamente embrionário, vem se questionando a produção dessas células germinativas após o nascimento, processo denominado neo-ovogênese. Diferentes estudos vêm sendo apresentados para demonstrar a ocorrência da nova teoria, como a existência de células-tronco germinativas no epitélio do ovário ou de células-tronco de medula óssea. Dessa forma, é importante o estudo da neo-ovogênese, já que a mesma poderá proporcionar um benefício inigualável para a área de reprodução assistida.

A literature review about the origin of primary oocytes in ovaries of female adult mammals is shown. Although it was considered only an embryonic process, the production of the germ cells after birth has been questionated, a process called neoovogenesis... Different studies have been shown to prove the occurrence of this new theory, like the existence of germ stem cells in ovarian germ epithelial or stem cells from bone marrow. Like this, it is important to study the neoovogenesis, since it may provide a unique benefit to the area of assisted reproduction.

Mecanismos fisiológicos e bioquímicos envolvidos na ovogênese / Physiological and biochemical mechanism involved in ovogenesis

O artigo refere-se a uma atualização sobre os mecanismos fisiológicos e bioquímicos envolvidos na ovogênesis de mamífero.(AU)

The article concern with an up to date about physiologic and biochemical mechanism of ovogenesis in mammals.(AU)

Determinação da razão ótima de espermatozóides por ovócitos de piabanha Brycon insignis (pisces - characidae) / Determination of the optimum ratio of spermatozoa per oocyte of the piabanha Brycon insignis

Determinou-se a razão ótima de espermatozóides por ovócitos da piabanha Brycon insignis, utilizando-se dois machos e duas fêmeas da espécie, submetidos ao procedimento de desova induzida. Os gametas foram extrusados manualmente 200 horas-grau após a aplicação do extrato bruto de hipófise. Os ovócitos foram misturados e deste pool retiraram-se amostras com 2g de ovócitos (701 ovócitos/g). O sêmen do pool foi diluído em solução de NaCL 1,2 por cento de tal forma que, após a adição de 1ml do sêmen diluído aos ovócitos, fossem obtidas as seguintes razões espermatozóides por ovócitos em cada tratamento: T1=86.662, T2=173.324, T3=259.986, T4=346.648 e T5=433.310. A taxa de fertilização do sêmen não diluído usado como controle foi de 65,3 por cento. Após ativação espermática com NaHCO3 1 por cento e fecundação, os ovos foram transferidos para as incubadoras e nelas foram observadas as seguintes percentagens de fertilização em relação à do grupo-controle: T1=35,7 por cento, T2=53,1 por cento, T3=79,1 por cento, T4=93,4 por cento e T5=87,8 por cento. A percentagem de fertilização (em relação ao controle) aumentou de forma linear, segundo a equação de regressão: Y=15,55+0,0002297X (P<0,01; R²=0,98), até a proporção de 314.481 espermatozóides por ovócitos, após o que a taxa de fertilização se estabilizou no limite de 88 por cento

The optimum spermatozoa:oocyte ratio of piabanha Brycon insignis was studied. Two males and two females were induced to spawn, and the gametes were stripped after 200 hourgrades starting from the application of carp pituitary gland. Oocytes from two females were mixed, and samples of 2g (701 oocytes/g) were collected from the obtained pool and placed into plastic cups. The semen from the two males, after mixed to compose a pool, was diluted in NaCl solution (1.2 percent) so that, after the addition of 1ml of diluted sperm into the oocytes, the following spermatozoa:oocyte ratios (tri-replicated) were obtained: T1=86,662, T2=173,324, T3=259,986, T4=346,648 and T5=433,310. After the activation using 1 percent NaHCO3 and fertilization, the eggs were transferred to incubators, and observed the percentages of fertilization relative to the control. T1=35.7 percent, T2=53.1 percent, T3=79.1 percent, T4=93.4 percent and T5=87.8 percent. Undiluted semen was used as "control", which showed 65 percent of fertilization. The percentage of fertilization (relative to the control) increased linearly according to the regression Y= 15.55 + 0.0002297X (P<0.01; R²=0.98), until the proportion of 314,481 spermatozoa per oocyte, and, from this point, the fertilization rate maintained at 88 percent

No maleficenciaee investigación con células madre embrionarias / Non-maleficiencies in research with embryonic stem cells

La investigación con células madre embrionarias genera un debate ético sobre su obtención. Se han propuesto distintos métodos que intentan salvar este conflicto, como son la obtención de una única célula embrionaria, la transferencia nuclear alterada, el uso de embriones detenidos y la reprogramación celular. En este artículo se reflexiona sobre la valoración ética de estas nuevas técnicas y otros aspectos atinentes a la investigación con células madre embrionarias en relación con el principio de no maleficencia.

Research with embryonic stem cells generates a debate about its source. Different methods have been developed to save the conflict: obtaining a unique embryonic cell or using either altered nuclear transfer or arrested embryos, and cellular reprogramming. We are trying in this article to evaluate these new techniques as well as other aspects related to research with embryonic stem cells, starting from the "not to harm" principle.

A pesquisa com células-mães embrionárias origina um debate ético por sua obtenção. Para resolver este conflito, têm sido propostos diversos métodos: a obtenção duma única célula embrionária, a transferência nuclear alterada, o uso dos embriões detidos e a re-programação celular. Neste artigo reflexionamos sobre a valoração ética destas novas técnicas e outros aspectos relacionados com a pesquisa com células-mães embrionárias, vinculada com o princípio da maleficência.

Genómica funcional en embriones y ovocitos humanos individuales / Functional genomics in single embryo and human oocytes

Durante tres décadas, el análisis de embriones y ovocitos humanos ha consistido principalmente, en su evaluación morfológica o citogenética; paulatinamente se han incorporado técnicas moleculares como FISH y PCR. Sin embargo, el desarrollo de nuevos métodos de amplificación de RNA, usando células individuales, ha permitido analizar la expresión génica en ovocitos, complejos cúmulo-ovocito y embriones de preimplantación. Estas técnicas revolucionarán el estudio de la biología reproductiva humana y la reproducción asistida, permitiendo un análisis objetivo y poderoso de los complejos procesos e interacciones del inicio de la vida, explicando las causas de la infertilidad humana y generando nuevas terapéuticas para ésta.

During three decades human embryo and oocyte analyses have been performed based on morphological or cytogenetical evaluations; molecular techniques, like FISH and PCR, have been gradually incorporated. However, the development of new techniques of individual cell RNA amplification has allowed the analysis of gene expression in oocytes, cumulus-oocyte complex and preimplantation embryos. These techniques will change radically the study of human reproductive biology and assisted reproduction, allowing a powerful and objective analysis of the complex processes and the interactions that may explain the causes of infertility and generate new therapeutics.

Maduración in vitro de ovocitos de gatas tratadas con hormona folículo estimulante (FSH) / In Vitro Maturation of Cat Oocytes Obtained From Females Treated with Follicle Stimulating Hormone

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del tratamiento con hormona folículo estimulante (FSH) sobre la calidad y potencial de maduración in vitro (MIV) de ovocitos de gata. Veintiún gatas adultas fueron asignadas aleatoriamente a grupos de estudio. Grupo FSH (n = 9) 5 mg NIH/día de Foltropin-V por 4 días vía subcutánea y Grupo Control (n = 12) 1 mL de suero fisiológico por 4 días vía subcutánea. Los ovarios fueron obtenidos quirúrgicamente y transportados al laboratorio dentro de las 4 horas subsiguientes a 37°C. Los complejos cumulus-ovocito (CCOs) fueron obtenidos por rebanado ovárico, seleccionándose por criterios morfológicos aquellos considerados aptos para MIV. Se utilizó como medio de maduración TCM-199, BSA (0,4%), FSH (1µL/mL), LH (1µL/mL), 17beta estradiol (1µg/mL), gentamicina (50 µg/mL) y piruvato (0,2 mM). El cultivo se realizó durante 24 horas a 38,5°C con 5% de CO2. Posteriormente los ovocitos fueron denudados, fijados y teñidos para evaluar la maduración, considerándose maduros aquellos en metafase II. Se recuperaron en promedio por hembra 10,6 ± 3,6 y 7,1 ± 2,8 CCOs aptos para MIV en los grupos FSH y Control respectivamente (P <= 0,05). Se recuperó un 25,6% de CCOs aptos para MIV en el grupo FSH y 17% en el grupo Control (P <= 0,05). La tasa de MIV para el grupo FSH fue de un 73,6% versus 49,4% en el grupo Control (P <= 0,05). Se concluye que el tratamiento con FSH aumenta el número de CCOs aptos para MIV y que estos presentarían un mayor potencial de maduración.

The aim of this research was to evaluate the effect of Follicle Stimulating Hormone (FSH) treatment on quality and in vitro maturation potential of cumulus-oocyte complexes (COCs) recovered from domestic cats. Twenty-one mature cats were randomly assigned to two groups, FSH (n=9) and Control (n=12). Cats in FSH group were treated with 5 mg of Folltropin-V subcutaneously every 24 hours, for 4 consecutive days. Cats in Control group received 1 mL of sterile saline solution every 24 hours for 4 days. Ovaries were obtained surgically 24 hours after the end of the gonadotrophic treatment. Ovaries were then transported to the laboratory at 37°C within 4 hours after surgery. COCs were recovered by slicing, and classified according to morphological features. Maturation medium was based on TCM-199, and supplemented with 0.4% BSA, 1µL/mL FSH, 1µL/mL LH y 1µg/mL of 17ß oestradiol, 50 µg/mL gentamicin, 0.20 mM sodium pyruvate. The maturation period was of 24 hours under 38.5°C, 5% CO2 and saturated humidity. After this period oocytes were denuded, fixed and stained to asses their maturational status. Oocytes were considered mature when it was observed the presence of metaphase II plate and the expulsion of the first polar body. An average of 10.6 ± 3.6 and 7.1 ± 2.8 excellent and good quality COCs were recovered from cats in FSH and Control group respectively (P <= 0.05). Twenty five point six percent (25.6%) and 17% of recovered COCs from FSH and Control group respectively were classified as excellent or good (P <= 0.05). In vitro maturation rate was of 73.6% and 49.4% for the FSH group and the control group respectively (P <= 0.05). It can be concluded that FSH treatment increases the number of excellent and good quality oocytes obtained from cats and that these oocytes present a higher in vitro maturation potencial.

Ultrastructural aspects of the intercellular bridges between female bee germ cells

The germline cells in the ovary of the female bee are interconnected by intercellular bridges kept open by cytoskeletal reinforcements in the plasmic membrane. These bridges among the germline cells display a dynamic behavior and probably act in the determination of the oocyte among the cells of the clone formed by the premeiotic mitoses, subsequently forming a pathway that enables the products synthesized by the nurse cells to reach the oocyte during its maturation. The cytoskeletal elements in the intercellular bridges of bee gonads are basically microfilaments and microtubules, but another type of filament (thick, of non-defined nature, associated with elements of the endoplasmic reticulum) is present in the bridges between the premeiotic cystocytes. This filament crosses the bridge, using microfilaments to fasten itself to the plasmic membrane. These filaments appear to control the span of the bridge. Upon completion of the proliferation phase the cystocytes take on a rosette shape, and a fusome formed by the convergence of the bridges appears at their center. The thick filaments are not present in this conformation. The differentiation of the oocyte and the nurse cells leads to a new change, in which the bridges are reoriented to convey the content of the future nurse cells to the oocyte.

No ovário das abelhas as células germinativas e as células foliculares são interconectadas por pontes intercelulares mantidas abertas por reforços do citoesqueleto na membrana plasmática. As pontes entre as células germinativas têm comportamento dinâmico e provavelmente atuam na determinação do ovócito entre as células do clone formado pelas mitoses pré meióticas formando posteriormente uma via de transporte para que os produtos sintetizados pelas células nutridoras atinjam o ovócito durante sua maturação. Os elementos do citoesqueleto presentes nas pontes intercelulares das gônadas das abelhas são basicamente microfilamentos e microtúbulos, mas nas pontes entre os cistócitos pré-meióticos outro tipo de filamento (espesso de natureza não definida, associado a elementos do retículo endoplasmático) está presente, atravessando a ponte e prendendo-se através dos microfilamentos à membrana plasmática. Estes filamentos aparentemente controlam o vão da ponte. Terminada a fase de proliferação os cistócitos tomam a forma de uma roseta e um fusoma, formado pela convergência das pontes, aparece no centro desta. Nesta conformação os filamentos grossos não estão presentes. Nova mudança ocorre com a diferenciação do ovócito e das células nutridoras, com a reorientação de todas as pontes de maneira a canalizar o conteúdo das futuras células nutridoras para o ovócito.

Mating influence in the ovary differentiation in adult queens of Apis mellifera L. (Hymenoptera, Apidae)

The present results show that in the ovarioles of a newly emerged (0 day) queen of A. mellifera only two regions may be distinguished: a proximal, short germarium and a very long distal, terminal filament. As the queen matures and gets ready for the nupcial flight, the germarium increases in lenght, advancing towered the distal end, as the terminal filament shortens. The ovarioles of queens ready to mate (6 to 8 days old) have, already one or two ovarian follicles, i.e. a very short proximal vitellarium, but a real vitellogenesis only starts after the fecundation. If the queen does not mate the ovarioles structure is disrupted (12-16 days old). In mated queen eggs the ovarioles present three differentiated regions, from the apice to the basis: a short terminal filament, a medium size germarium, and a very long basal vitellarium. As the eggs are laid, the emptied follicle collapses, degenerates and produces a corpus luteum.

Os resultados do presente trabalho demonstram que nos ovaríolos da rainha de Apis mellifera recém-emergida (0 dia) apenas duas regiões podem ser distinguidas: um curto germário proximal e um longo filamento terminal distal. À medida que a rainha amadurece e fica pronta para o vôo nupcial, o comprimento do germário aumenta e avança em direção à região distal e o filamento terminal diminui. Os ovaríolos da rainha pronta para acasalar (6 a 8 dias) têm 1 ou 2 folículos ovarianos, isto é, um vitelário proximal muito pequeno, mas a vitelogênese propriamente dita somente se inicia após a fecundação. Nas rainhas não acasaladas os ovaríolos se desestruturam (12-16 dias). Nas rainhas acasaladas os ovários apresentam os ovaríolos divididos em três regiões, do ápice para a base: um filamento terminal pequeno, um germário médio e um vitelário muito longo. Quando os ovos são postos, os folículos esvaziados colapsam, produzem um corpo lúteo e finalmente degeneram.